ELISA: NGUYÊN LÝ, PHÂN LOẠI, ỨNG DỤNG, SẢN PHẨM

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), còn được gọi là enzyme immunoassay (EIA), là một kỹ thuật sinh hóa sử dụng chủ yếu trong miễn dịch học để phát hiện sự hiện diện của một kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu. ELISA được sử dụng như một công cụ chẩn đoán trong y học, nông nghiệp cũng như các ngành công nghiệp.

Nguyên lý

Nguyên lý của kỹ thuật ELISA là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và được thực hiện bằng những bước cơ bản sau: Kháng nguyên - antigen (KN) hoặc Kháng thể - antibody (KT) đã biết được gắn trên một giá thể rắn, sau đó cho mẫu có chứa kháng thể - antibody (KT) hoặc kháng nguyên (KN) cần tìm vào giếng. Bổ sung thêm kháng thể có gắn với ezyme. Bước cuối cùng thêm cơ chất (substance), enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu màu có thể xác định được bằng máy đo huỳnh quang. Số lượng enzyme phân hủy cơ chất tỉ lệ thuận với cường độ màu, qua đó, tỷ lệ với lượng kháng nguyên ban đầu. Giữa mỗi bước, các đĩa giếng thường được rửa bằng dung dịch tẩy nhẹ để loại bỏ các protein hoặc các kháng thể tự do.

Phân loại

ELISA có thể được thực hiện ở các định dạng khác nhau dựa trên sự khác biệt trong việc cố định kháng nguyên và đánh dấu kháng thể. Có thể phân chia ELISA thành 2 loại hình là ELISA dị pha và ELISA đồng pha.

ELISA dị pha:

Đối với ELISA dị pha, các yếu tố cần chẩn đoán được tách ra khỏi hỗn hợp dung dịch mẫu bằng cách cố định lên một bề mặt rắn tạo thành 2 pha cố định và tự do, theo sau là một bước loại bỏ pha tự do. Yếu tố phát hiện được thêm vào sau đó để phát hiện sự hiện diện của yếu tố chẩn đoán còn lại trên pha cố định thông qua hoạt tính của enzyme. Trong ELISA dị pha có 4 biến thể chính: ELISA trực tiếp, ELISA gián tiếp, ELISA Sandwich và ELISA cạnh tranh

• ELISA trực tiếp:

Kỹ thuật ELISA trực tiếp: là phương pháp ELISA đơn giản nhất, thường sử dụng trong ELISA định tính, ít dùng trong định lượng. Kháng nguyên (Antigen- Ag) được hấp phụ lên một tấm nhựa, sau đó một lượng lớn của một loại protein (thường là albumin huyết thanh bò- BSA) được thêm vào để khóa tất cả các vị trí liên kết khác. Trong lúc đó, một loại enzyme (yếu tố phát hiện) được thêm vào sẽ liên kết với một kháng thể trong một phản ứng riêng biệt, phức hợp enzyme- kháng thể này được sử dụng để hấp phụ các kháng nguyên. Sau khi phức enzyme- kháng thể dư thừa bị loại bỏ hết, phức hợp enzyme- kháng thể nào gắn với kháng nguyên sẽ còn lại trên giếng. Bằng cách thêm vào cơ chất của enzyme, tín hiệu phát ra đại diện cho lượng kháng nguyên trong mẫu.

Ưu điểm:

• Chỉ cần một lần ủ do đó tiết kiệm thời gian và tối thiểu được việc kiểm soát các điều kiện trong quá trình thực hiện (thay đổi nhiệt độ và buffer cho mỗi lần ủ, tính thời gian…).

• Chỉ có một kháng thể nên hầu như không có nguy cơ xảy ra phản ứng chéo kháng thể.

Nhược điểm:

• Quá trình phát triển bộ KIT xét nghiệm tốn thời gian - mỗi mục tiêu xét nghiệm yêu cầu một kháng thể sơ cấp liên hợp enzyme cụ thể.

• Nhuộm màu nền (background staining) cao do sự liên kết không đặc hiệu của kháng thể với bề mặt rắn và các protein cố định trên bề mặt rắn.

• Việc đánh dấu từng loại kháng thể sử dụng cho mỗi kháng nguyên cũng khá tốn kém, nhất là khi phải chẩn đoán một số lượng lớn các loại kháng nguyên khác nhau.

• Nhiễu nền cao do tất cả các protein trong mẫu liên kết với bề mặt.

Các bước tiến hành cũng tương tự ELISA trực tiếp nhưng sau khi kháng nguyên được hấp thụ vào các đĩa, và sau bước cho BSA, các kháng thể tiếp theo sẽ được thêm vào là các kháng thể sơ cấp, chọn lọc đặc hiệu với các kháng nguyên (kháng thể này không gắn enzyme). Sau đó, một kháng thể thứ cấp gắn enzyme đã được chuẩn bị sẽ được thêm vào đĩa nhằm phát hiện các kháng thể hấp phụ với kháng nguyên.

Nhằm tăng khả năng phát hiện, người ta có thể sử dụng kỹ thuật nối cầu (brigde) bổ trợ cho ELISA gián tiếp. Về nguyên tắc, brigde cũng tương tự như ELISA gián tiếp nhưng sử dụng nhiều lớp yếu tố phát hiện hơn. Qua mỗi lớp yếu tố phát hiện, tín hiệu lại được khuếch đại lên vài lần. Tuy nhiên càng nhiều lớp thì số bước thực hiện càng tăng.

Ưu điểm:

• Tính linh hoạt cao: cùng một kháng thể thứ cấp có thể được sử dụng cho nhiều loại kháng thể sơ cấp.

• Độ nhạy cao - nhiều hơn một kháng thể được đánh dấu có thể liên kết với kháng thể chính.

• Phản ứng miễn dịch chọn lọc cao - không có nhiễu can thiệp vào các vị trí trên kháng thể chính.

• Kinh tế - yêu cầu ít loại kháng thể đánh dấu (gắn enzyme).

Nhược điểm:

• Quy trình làm việc phức tạp hơn - cần có thêm một bước ủ cho kháng thể thứ cấp.

• Khả năng phản ứng chéo - tín hiệu không đặc hiệu do phản ứng chéo với kháng thể thứ cấp.

• ELISA Sandwich:

ELISA sandwich là một loại ít phổ biến của kỹ thuật ELISA, nhưng rất hiệu quả trong việc phát hiện kháng nguyên trong mẫu. Hơn nữa, nhiều bộ kit thương mại ELISA được xây dựng dựa trên loại ELISA này.

ELISA sandwich định lượng kháng nguyên giữa hai lớp kháng thể (kháng thể bắt- capture và phát hiện- detection). Các kháng nguyên được định lượng phải chứa ít nhất hai epitope kháng nguyên có khả năng liên kết với các kháng thể, ít nhất là với hai kháng thể hoạt động trong kỹ thuật sandwich. Các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng đều có thể được sử dụng như là các kháng thể bắt và kháng thể phát hiện trong hệ thống ELISA sandwich. Kháng thể đơn dòng có một epitope duy nhất cho phép phát hiện và định lượng tốt sự khác biệt nhỏ trong kháng nguyên. Một kháng thể đa dòng thường được sử dụng như các kháng thể bắt giữ càng nhiều kháng nguyên càng tốt. ​(Epitope- Quyết định kháng nguyên, là vị trí trên kháng nguyên, nơi gắn với kháng thể).

Quy trình ELISA sandwich có thể khó khăn để tối ưu hóa và cần phải kiểm tra các kháng thể bắt cặp sai. Điều này đảm bảo các kháng thể này phát hiện được các epitope khác nhau trên một protein đích để chúng không cản trở các kháng thể đang gắn.

Ưu điểm:

• Tính linh hoạt và độ nhạy cao: có thể sử dụng cả phương pháp trực tiếp (đơn lớp) và gián tiếp (hai lớp).

• Độ đặc hiệu cao - hai kháng thể được sử dụng để phát hiện kháng nguyên.

• Thích hợp cho các mẫu phức tạp - không yêu cầu phải tinh sạch kháng nguyên trước khi đo.

Nhược điểm:

• Quy trình làm việc phức tạp - yêu cầu nhiều bước ủ hơn so với các định dạng ELISA khác.

• Quy trình phát triển KIT phức tạp – do phải kiểm tra phản ứng chéo giữa các kháng thể khác nhau

• ELISA cạnh tranh:

ELISA cạnh tranh sử dụng một lượng kháng nguyên cùng loại với kháng nguyên mà ta muốn định lượng trong mẫu (kháng nguyên cạnh tranh) cho phản ứng miễn dịch với cùng một loại kháng thể đặc hiệu cố định trên mặt rắn, sau đó đo lượng kháng nguyên cạnh tranh này thông qua hoạt tính enzyme được liên kết với nó. Kháng nguyên cạnh tranh càng hiện diện nhiều cho biết loại kháng nguyên đó trong mẫu càng ít và ngược lại.

Có 3 biến thể chính của ELISA cạnh tranh:

• Phương pháp bão hòa cân bằng tương đối (quasi-equilibrium saturation): kháng nguyên mẫu và kháng nguyên cạnh tranh được cho phản ứng cùng lúc với một kháng thể được cố định. Hai loại kháng nguyên sẽ phản ứng miễn dịch với kháng thể theo một tỷ lệ tương ứng với tỷ lệ nồng độ giữa hai loại kháng nguyên, từ đó có thể xác định được nồng độ kháng nguyên mẫu khi đo tỉ lệ lượng kháng nguyên cạnh tranh còn lại sau phản ứng với lượng kháng nguyên cạnh tranh ban đầu. Cần lưu ý là lượng kháng nguyên cạnh tranh phải được biết trước và phải dư để bão hòa hết kháng thể.

• Phương pháp bão hòa thứ tự (sequential saturation): kháng nguyên mẫu được cho phản ứng trước, sau đó một lượng dư kháng nguyên cạnh tranh được cho vào để bão hòa lượng kháng thể còn trống. Hoạt tính enzyme đo được sẽ cho biết lượng kháng nguyên cạnh tranh phản ứng với kháng thể còn trống, từ đó tính được lượng kháng nguyên mẫu đã chiếm chỗ kháng thể. Một biến thể của phương pháp này đó là kháng thể không được cố định trước, mà sau khi phản ứng lần lượt với kháng nguyên mẫu và kháng nguyên cạnh tranh thì sẽ được cố định lại bằng cách phản ứng với kháng kháng nguyên được cố định trên mặt rắn.

• Phương pháp ức chế kháng thể (antibodies inhibition): thay vì cố định kháng thể lên mặt rắn thì có thể cố định kháng nguyên cạnh tranh. Đầu tiên sẽ cho kháng nguyên mẫu phản ứng với một lượng kháng thể biết trước. Sau đó, lượng kháng thể còn lại chưa phản ứng sẽ được phản ứng với kháng nguyên cạnh tranh và được cố định lại. Sau bước rửa, có thể đo lượng kháng thể còn cố định lại và suy ra lượng kháng thể đã phản ứng với kháng nguyên mẫu.

Ưu điểm:

• Tính linh hoạt cao nhất - có thể dựa trên định dạng ELISA trực tiếp, gián tiếp hoặc sandwich

• Độ đặc hiệu cao nhất - kháng nguyên được bắt và phát hiện cụ thể

• Khuếch đại tín hiệu mạnh - giảm thiểu ảnh hưởng của việc pha loãng mẫu và hiệu ứng nền mẫu

Nhược điểm:

• Khá tốn thời gian – quy trình phức tạp

• Phụ thuộc nhược điểm của định dạng phát hiện đã chọn

1. ELISA đồng pha:

Phương pháp này thường được sử dụng để định lượng các phân tử nhỏ, không cần bước tách biệt các yếu tố gắn kết và tự do vì nó dựa trên sự thay đổi hoạt tính của enzyme thông qua phản ứng liên kết miễn dịch.

Phương pháp này có hai loại hình là đồng pha không cạnh tranh và đồng pha cạnh tranh. Đối với ELISA đồng pha không cạnh tranh, đơn giản chỉ sử dụng enzyme liên kết với kháng thể sao cho phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên và kháng thể sẽ thay đổi hoạt tính enzyme. ELISA đồng pha cạnh tranh được sử dụng nhiều hơn, với sự cạnh tranh giữa kháng nguyên mẫu và kháng nguyên cạnh tranh. Ở đây, kháng nguyên cạnh tranh có thể được đánh dấu với enzyme, cơ chất của enzyme, co-factor, inhibitor,… Còn về mặt biến đổi hoạt tính enzyme thì có nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng như gắn kháng nguyên cạnh tranh với enzyme, với cơ chất của enzyme, với co-factor hay inhibitor của enzyme, với advidin.

Ưu điểm:

• Giảm độ phức tạp của phản ứng trong việc cố định các yếu tố lên bề mặt rắn.

• Thời gian thực hiện nhanh, giảm được lượng kháng thể cần dùng.

Nhược điểm:

• Cần có những thiết kế chính xác về cấu trúc không gian của các thành phần, một yêu cầu khá phức tạp và tốn kém.

• Kết quả có thể bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố có khả năng biến đổi hoạt tính enzyme.

Ứng dụng

• Đối với y học kỹ thuật:

• Đo lượng kích thích tố tuyến giáp: T3, T4, FT3, FT4

• Xét nghiệm nội tiết tố sinh dục: Estradiol, FSH, Visual – HCG, LH, Progesterone, Prolactin, Testosterone, Cortisol..

• Phát hiện các dấu ấn ung thư: CEA, AFP, PSA, NSE, Beta HCG, CA 153, CA199, CA 125….

• Là một trong các kĩ thuật xét nghiệm HIV nhằm phát hiện kháng nguyên p24.

• Giúp chẩn đoán các loại vi khuẩn, virus và ký sinh trùng.

• Đối với thú y và trồng trọt:

• Phát hiện các kháng nguyên và kháng thể trên động vật.

• Đo lượng hormone.

• Chẩn đoán các vi khuẩn như Mycoplasma, Pasteurella, E. coli, Samonella,… và virus như AFSV, PRRSV, PPV, PCV2, CSFV, ADV, PEDV,…

• Đánh giá hiệu quả tiêm phòng, kiểm tra các kháng thể truyền từ mẹ sang con.

• Đánh giá mức độ kháng thể.

• Chẩn đoán tác nhân gây bệnh cây trồng.

• Đánh giá biểu hiện gen trên thực vật chuyển gen.

• Đối với công nghiệp:

• Xác định độc tố, chất gây dị ứng trong thực phẩm.

• Kiểm nghiệm vi sinh vật trong thực phẩm.

Sản phẩm

Để xây dựng một hệ thống ELISA bán tự động, cần trang bị 3 thiết bị chính, bao gồm: máy ủ, máy rửa ELISA và máy đọc ELISA.

Công ty Cổ phần Công nghệ TBR hiện cung cấp trọn bộ giải pháp ELISA bao gồm các thiết bị:

• Máy đọc ELISA Accuris Microplate Reader từ Benchmark/Accuris - Mỹ (MR9600).

 

• Máy lắc, ủ nhiệt đĩa ELISA INCU-MIXER™ MP HEATED MICROPLATE VORTEXER SERIES từ Benchmark – Mỹ (H6004, H6002) và các loại máy ủ nhiệt khác.

Đồng thời, chúng tôi cũng cũng cấp các thuốc thử cũng như vật tư tiêu hao cần thiết cho xét nghiệm ELISA.

 

THAM KHẢO

1. R. H. Burdon, P. H. van Knippenberg, 1985, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 15, Practice and Theory of Enzyme Immunoassays, Edited by P. Tijssen, ELSEVIER.

2. John M. Walker, 2008, Methods in Molecular Biology, volume 516, Edit by John A. Crowther, The ELISA Guide Book, Humana Press, Springer, New York, USA.

3. John M. Walker, 1995, Methods in Molecular Biology, volume 42, Edit by John A. Crowther, ELISA: Theory And Practice, Humana Press, Springer, New York, USA.

4. https://pacificlab.vn/

5. https://vi.wikipedia.org/