TÁCH CHIẾT DNA/RNA BẰNG CỘT SILICA- NGUYÊN LÝ, QUY TRÌNH, CÁCH LỰA CHỌN MỘT BỘ KIT TÁCH CHIẾT CỘT PHÙ HƠP?

Tách chiết DNA/RNA (nucleic acid) là phương pháp cơ bản được sử dụng phổ biến trong sinh học phân tử nhằm thu nhận DNA, RNA tinh sạch. Quá trình này được xem là điểm khởi đầu quan trọng cho nhiều ứng dụng từ nghiên cứu cơ bản đến việc phát triển các phương pháp sàng lọc trong chẩn đoán, điều trị bệnh. Ngày nay, phần lớn các phòng thí nghiệm đều sử dụng các bộ kit thương mại dùng cột silica cho việc tách chiết nucleic acid. Hầu hết chúng đều được tối ưu sao cho quá trình tách chiết có thể diễn ra dễ dàng, hiệu quả và nhanh chóng hơn. Tuy nhiên, các vấn đề dù ở đâu hay bất kì nơi nào đều cũng sẽ gặp phải, do đó việc hiểu biết về quy trình, lưu ý, cơ chế diễn ra bên trong các bộ hóa chất se giúp ngăn chặn hoặc giải quyết các rắc rối dễ dàng hơn. Với hơn 10 năm kinh nghiệm trong lĩnh vực sinh học phân tử, TBR sẽ giải thích chi tiết về cơ chế, quy trình, cách lựa chọn một bộ kit tách chiết bằng cột silica cho các bạn nhé.

Nguyên lý tách chiết DNA/RNA bằng cột silica

Tách chiết cột là phương pháp cho hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch DNA cao. Nguyên tắc tách chiết cột silica dựa trên hoạt động của muối chaptropic (bao gồm guanidine HCl, guanidine thiocyanate, urea, và lithium perchlorate) sẽ làm mất ổn định liên kết hydro, lực Van Der Walls và tương tác kị nước tạo điều kiện để chuyển nucleic axit lên màng silica. Sau đó tiến hành rửa các thành phần tạp nhiễm còn sót lại trên màng và ly tâm làm khô cột. Cuối cùng thu nhận nucleic axit tinh sạch nhằm mục đích sử dụng tiếp theo hoặc lưu trữ ở -20⁰C. Quy trình chung thường thực hiện như sau:

Hình 1: Quy trình tách chiết DNA/RNA bằng cột silica

Giai đoạn ly giải (Lys):

Các tế bào thu nhận cần được xử lý với các dung dịch đệm ly giải có chứa các muối chaotropic (muối hoạt động bề mặt). Các muối này có tác dụng làm mất ổn định các liên kết yếu tạo điều kiện cho nucleic acid có thể liên kết với lớp màng silica. Đồng thời, chaotropic các protein bao gồm các nuclease cũng bị mất ổn định.

Ngoài ra, tùy thuộc vào loại mẫu, các chất phụ trợ ly giải như proteinase K sẽ được thêm vào giúp gia tăng hiệu suất của quá trình ly giải. Proteinase K là enzyme có khả năng biến tính các protein, đặc biệt là các protein trên màng tế bào. Enzyme này hoạt động ở nhiệt độ cao và kém bền trong dung dịch đệm ly giải, do đó nên được bổ sung trước kho cho các muối ly giải vào.

Hình 2: Cấu tạo cột Silica 

Giai đoạn gắn kết (Binding)

 Sau khi các nucleic acid được giải phóng ra khỏi tế bào, dung dịch Ethanol hoặc Isopropanol được thêm vào và kết hợp các muối chaotropic có trong dung dịch ly giải tạo nên điều kiện để chúng gắn kết lên lớp màng silica có trong cột. Hỗn hợp dung dịch đi qua cột nhờ máy ly tâm hoặc máy hút chân không.

Cần lưu ý, nồng độ và thể tích của ethanol có sự ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu quả của quá trình. Khi lượng Ethanol quá lớn, các nucleic acid sẽ dễ bị đứt gãy và ngược lại, khi Ethanol quá ít thì các acid nucleic sẽ gắn kết không hoàn, làm giảm hiệu suất thu hồi của quá tình tách chiết.

Giai đoạn rửa (Washing)

Sau quá trình ly tâm, ngoài các thành phần chính DNA/RNA được giữ lại trên màng, một số thành phần khác như protein, polysaccharide hoặc muối vẫn bị sót lại. Vì vậy, cần tiến hành loại bỏ chung thông qua dung dịch rửa, thường sẽ có hai loại dung dịch chuyên dụng. Dung dịch rửa đầu tiên có chứa nhiều muối nhằm loại bỏ hiệu quả các protein, sắc tố, sau đó tiến hành rửa với dung dịch sau có chứa nồng độ ethanol cao giúp loại bỏ các muối. Việc loại bỏ muối đóng một vai trò quan trọng trong quá trình thu nhận, nếu lượng muối tồn dư cao dẫn đến việc khó thủy phân các liên kết ở giai đoạn thu nhận và dẫn đến hiệu suất thấp.

Giai đoạn làm khô (Elution)

Ethanol là một chất ức chế đổi với phản ứng chuỗi PCR, vì vậy trước khi thu nhận chúng ta cần loại bỏ hoàn toàn lượng ethanol tồn dư còn sót lại trên màng. Quá trình này được thực hiện bằng việc loại bỏ dịch thu nhận và ly tâm thêm một lần nửa. Ngoài ra, việc sót ethanol cũng sẽ hạn chế các nucleic acid bị hydrat hóa hoàn toàn và dẫn đến hiệu suất thấp.

Giai đoạn rửa giải (Pure DNA Extract)

Đối với DNA, do đặc tính ổn định ở môi trường pH kiềm nhẹ và tan nhanh trong đệm nên đệm Tris HCl 10mM ở pH nằm trong khoảng 8-9 thường được sử dụng làm đệm rửa giải. Ngược lại RNA lại ổn định tốt trong môi trường pH acid nhẹ và hòa tan hoàn toàn trong nước nên nước là dung dịch phù hợp để rửa giải (pH của nước thường nằm trong khoảng 4-5). Quá trình rửa giải đạt hiệu quả cao nếu cho dung dịch rửa giải vào và chờ 1-2 phút rồi mới đem ly tâm thu dịch.

Các lưu ý khi chọn một bộ kit tách chiết cột silica

Khi lựa chọn một bộ kit tách chiết cột silica phù hợp, điều đầu tiên bộ kit này phải đảm bảo về chất lượng và hàm lượng DNA thu nhận được đủ để thực hiện các ứng dụng downstream.

Các yếu tố loại mẫu, loại nucleic acid và thể tích mẫu sẽ ảnh hưởng đến chất lượng và nồng độ DNA thu nhận và là các yếu quan trọng khi lựa chọn một sản phẩm tách chiết. Ngoài ra, việc xem xét về chi phí, thời gian, độ độc hại tiềm ẩn và các yêu cầu phòng thí nghiệm sẽ giúp đưa ra sự lựa chọn tối ưu cho nhu cầu tách chiết của người sử dụng.

 a. Loại mẫu:

Các bộ kit thương mại ngày này thường bao gồm đầy đủ các loại hóa chất giúp dễ dàng hơn cho quá trình tách chiết. Tuy nhiên, những hóa chất này thường được tối ưu dựa vào loại mẫu. Loại mẫu tạo nên sự khác biệt lớn đến quá trình tách chiết. Ví dụ tế bào thực vật sẽ có vách tế bào dày gây khó khăn hơn cho việc ly giải so với các tế bào vi khuẩn.

b. Loại nucleic acid

Cần cân nhắc lựa chọn các đối tượng mà bạn muốn thu nhận: RNA hoặc DNA bộ gene của virus, mRNA, DNA bộ gene, PCR product, DNA môi trường, DNA và RNA genome, plasmid, chromosome.

c. Ứng dụng

Tùy theo ứng dụng bạn muốn thực hiện mà các bộ kit tách chiết khác nhau có thể thực hiện. Ví dụ thí nghiệm của bạn thực hiện là end-point PCR se không có yêu cầu quá cao về lượng sản phẩm đầu vào so với NGS.

d. Thể tích mẫu

Cột silica đã được thiết lập giới hạn ở một thể tích nhất định theo hai cách: (1) khả năng tải và (2) khả năng liên kết tối đa của chính cột. Mặc dù tăng số vòng quay của máy ly tâm là một giải pháp đơn giản để tăng thể tích mẫu, nhưng việc thêm các bước quy trình sẽ làm tăng thêm thời gian, nhân công và tăng khả năng nhiễm chéo.

Nhiều nhà cung cấp cung cấp các định dạng kích thước khác nhau (ví dụ: mini, midi và maxi) để đáp ứng hiệu suất liên kết. Tuy nhiên, các quy cách lớn hơn thường liên quan đến việc tăng chi phí.

e. Công suất

Nếu bạn đang xử lý một số lượng nhỏ mẫu, thì một quy trình tách chiết cột có thể không quá tốn thời gian. Tuy nhiên, khi làm việc với một số lượng lớn các mẫu, việc tự động hóa nên được xem như một yếu tố cho việc lựa chọn. Tự động hóa quá trình tách chiết không chỉ có thể tăng năng suất và tăng độ chính xác mà còn giảm thời gian thực hiện và cải thiện chất lượng của nucleic acid được thu nhận.

Nguồn: Biomedia, Bioecho

Xem thêm:

1. Hướng dẫn sử dụng gelred trên gel agarose

2. Kỹ thuật giải trình tự thế hệ mới-hiệu năng cao (NGS)