TỔNG QUAN VỀ PCR và Real-time PCR

PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu có kích thước ngắn, do đó từ một lượng nhỏ DNA đích ban đầu, sau nhiều chu kỳ nhiệt, ta sẽ thu được một lượng lớn bản sao của DNA mạch khuôn này nhờ vào hoạt động của enzyme polymerase và cặp mồi đặc hiệu với đoạn trình tự mục tiêu. Sau đó, các sản phẩm PCR được thu nhận ở bước cuối cùng và trình tự DNA đích được phát hiện (định tính) thông qua điện di trên gel agarose.

1. PCR (Polymerase Chain Reaction) là gì?

PCR là một kỹ thuật được sử dụng để khuếch đại một đoạn DNA mục tiêu có kích thước ngắn, do đó từ một lượng nhỏ DNA đích ban đầu, sau nhiều chu kỳ nhiệt, ta sẽ thu được một lượng lớn bản sao của DNA mạch khuôn này nhờ vào hoạt động của enzyme polymerase và cặp mồi đặc hiệu với đoạn trình tự mục tiêu. Sau đó, các sản phẩm PCR được thu nhận ở bước cuối cùng và trình tự DNA đích được phát hiện (định tính) thông qua điện di trên gel agarose.

1.1 Nguyên tắc hoạt động của kỹ thuật PCR

Phản ứng PCR được thực hiện dựa trên nguyên tắc khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình luân nhiệt (20-40 chu kỳ) gồm 3 bước chính:

• Biến tính (95⁰C): nhiệt độ này khiến cho các liên kết hydro của DNA mạch đôi bị đứt gãy nên DNA mạch đôi tách thành mạch đơn.

• Bắt cặp (55⁰C – 65⁰C): cho phép các đoạn mồi bắt cặp bổ sung vào hai đầu của DNA khuôn.

• Kéo dài (72⁰C): mạch mới được tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung nhờ DNA polymerase

​2. Nguyên lý Real-time PCR (qPCR)

• Real-time PCR là một biến thể khác của PCR, về nguyên lý hoạt động thì chúng thực hiện tương tự như máy PCR thông thường cũng nhân bản số lượng lớn trình tự gen mục tiêu, từ đó cho phép phát hiện sự hiện diện của DNA đích đó (định tính), tuy nhiên, khác với PCR truyền thống, máy real-time PCR còn có thêm tính năng định lượng (định lượng tương đối, định lượng tuyệt đối) giúp đo lường được lượng sản phẩm khuếch đại ngay cả khi phản ứng đang diễn ra, tức là trong "thời gian thực".

  Bên cạnh bộ phận luân nhiệt tương tự như các dòng máy PCR truyền thống, máy real-time PCR còn có thêm bộ phân quang học giúp phát hiện, theo dõi tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Bộ phận này có khả năng chiếu ánh sáng kích thích vào từng ống phản ứng để kích thích phân tử phát huỳnh quang.

  Khi phân tử phát huỳnh quang nhận dược nguồn sáng kích thích sẽ trả lại tín hiệu ở một bước sóng khác và được ghi nhận. Như vậy, bằng cách đưa vào phản ứng một phân tử phát huỳnh quang, ta có thể phát hiện được tác nhân mục tiêu đồng thời sự gia tăng tính hiệu huỳnh quang cũng phán ảnh được số lượng bản sao DNA đích tạo ra càng nhiều sau mỗi chu kỳ nhiệt và ngược lại.

• Phân tử phát huỳnh quang được sử dụng cho mục đích này bao gồm thuốc nhuộm liên kết với DNA và đoạn mồi (primers) hoặc mẫu dò (probe) đặc hiệu vớitrình tự gen mục tiêu được đánh dấu huỳnh quan

​

Hình 1.1: Biểu đồ khuếch đại. Đường nền (baseline) – cắt ngang đi qua cường độ huỳnh quang nền được thể hiện trên biểu đồ

  Thành phần của phản ứng PCR và real-time PCR

3.  Ứng dụng PCR

 Thuốc

• Xét nghiệm đột biến bệnh di truyền

• Kiểm soát gen trong liệu pháp gen

• Chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm trên người: phát hiện vi khuẩn hoặc virus lây nhiễm như HIV, Viêm gan B (HBV), Viêm gan C (HCV), Ung thư cổ tử cung (HPV)…

Phân tich pháp y

• Xác định dấu vân tay di truyền

• Định danh tội phạm

• Xét nghiệm DNA, quan hệ huyết thống

Nghiên cứu và Di truyền học

• So sánh bộ gen của hai sinh vật trong các nghiên cứu về bộ gen

• Trong phân tích phát sinh gen của DNA từ bất kỳ nguồn nào như hóa thạch

• Phân tích biểu hiện gen

• Ngoài lĩnh vực y học, phương pháp PCR còn được áp dụng trong việc sản xuất các bộ kit chẩn đoán mầm bệnh trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: Xác định bệnh trên người, thú y, thủy sản, vi sinh thực phẩm, định danh,..

  Ứng dụng Real-Time PCR (qPCR)

• Chẩn đoán, phát hiện các bệnh trên người (như viêm gan B, viêm gan C, HPV, HIV, virus SARS, một số bệnh tình dục,…)

• Đánh giá được khả năng đáp ứng thuốc từ đó đưa ra phác đồ điều trị bệnh hiệu quả hơn cho bệnh nhân

• Đánh giá sự biểu hiện của một gen hay nhiều gen nhạy hơn so với kỹ thuật Microarray

• Chẩn đoán bệnh thú y, thủy sản và cây trồng

• Kiểm nghiệm an toàn thực phẩm, phát hiện vi sinh trong thực phẩm

• Phát hiện sinh vật biến đổi gen GMO

• Tài liệu tham khảo

  [1]      Kralik, P. and Ricchi, M. (2017), “A Basic Guide to Real Time PCR in Microbial Diagnostics: Definitions, Parameters, and Everything”, Frontiers in Microbiology, 8.

  [2]      PCR -Principle, Steps, Types, Components And Applications Of PCR: (2021), https://byjus.com/biology/pcr/. Accessed: 2023-05-15.